CLONACIÓN Y OBTENCIÓN DE MUTANTES DEL GEN DE LA FERRITINA EN UNA NUEVA ESPECIE DE Rhodococcus.
Gema Lordén Losada (1)
(1)Departamento de Biología Molecular, Area de Microbiologia, Facultad de Biología, Universidad de León, España.
Resumen La ferritina es una proteína capaz de almacenar hierro que se cree que desempeña un papel fundamental en la homeostasis de este metal en las bacterias del suelo, secuestrándolo cuando la célula lo toma en exceso, y liberándolo cuando es escaso para que la célula satisfaga sus necesidades metabólicas. Para aclarar la función de esta proteína en Rhodococcus, en este estudio se han obtenido mutantes y se ha delecionado el gen de la ferritina, viendo que los mutantes y las cepas que llevan el gen de la ferritina delecionado crecen peor en situaciones en las que hay exceso de hierro debido a que entran en estrés oxidativo. Así mismo también se purificó la proteína y se fusionó a la proteína GFP, para así ver su localización y como varía su concentración a lo largo del crecimiento celular.
Los miembros del género Rhodococcus están ampliamente distribuidos en los ambientes naturales, tales como suelos, aguas y sedimentos marinos. Este género pertenece a un grupo de microorganismos no esporulados, cuya principal característica es la presencia de ácidos micólicos y derivados en la pared celular , lo que los clasifica dentro de la clase Actinobacteria, junto con otros géneros relacionados como Mycobacterium, Nocardia, Corynebacterium y Gordonia (Hernandez et al. 2008). Actualmente, los miembros del género Rhodococcus aparecen en el volumen 4, sección XXIII de la segunda edición del Manual de Bergey de Bacteriología Sistemática (Garrity et al., 2002) como microorganismos Gram- positivos de elevado contenido en G+C, en lo que constituye la clase Actinobacteria, anteriormente citada.
Clasificación taxonómica del género Rhodococcus:
Reino: Bacteria
Filo: Actinobacteria
Clase: Actinobacteria
Subclase: Actinobacteridae
Orden: Actinomycetales
Suborden: Corynebacterineae
Familia: Nocardiaceae
Género: Rhodococcus
En este estudio hemos intentado averiguar cual es la función que desempeña la ferritina en Rhodococcus sp.(a partir de aquí se olvidó de poner cursivas) El hierro es un elemento esencial para casi todas las formas de vida, pero su insolubilidad y su alta reactividad pueden conducir a problemas de baja disponibilidad y toxicidad (en exceso induce estrés oxidativo) respectivamente (Chen, Bleam & Hickey 2009, Chen, Bleam & Hickey 2009). Un mecanismo usado para que las células tengan un aporte suficiente de hierro sin que entren en un estado tóxico, implica la presencia de proteínas capaces de almacenar este metal, conocidas generalmente por el nombre de ferritinas (Abdul-Tehrani et al. 1999). Las ferritinas han sido encontradas en animales, plantas y bacterias, donde se cree que juegan un importante papel en la homeostasis celular del hierro; lo secuestran cuando la célula lo toma en exceso, y lo liberan cuando es escaso para que la célula satisfaga sus necesidades metabólicas (Shi et al. 2008).
La importancia de las ferritinas se cree que radica en que almacenan el hierro en una forma rápidamente disponible y soluble para que puedan ser utilizadas como reservorio de hierro para el metabolismo, así como también podrían aliviar los efectos dañinos del hierro almacenándolo en una forma que no participa en las reacciones que generan radicales libres.(Bolann, Ulvik 1990)
2.MATERIALES Y MÉTODOS
Medios de Cultivo: Las cepas de Rhodococcus fueron cultivas aeróbicamente y crecidas a 30ºC en medio TSB (triptic soy broth) y las cepas de Escherichia coli fueron crecidas en medio LB (Luria Bertani) a 37ºC. En ambos casos se incubaron 50ml en matraces Erlenmeyer de 250 ml, agitándolos a 200rpm. El crecimiento celular se determinó monitorizando la densidad óptica a 600nm (DO600)(Dosanjh, Newton & Davies 2008). En los casos en los que se utilizó otro medio de cultivo y cuando éstos sean suplementados con antibióticos será indicado. En la tabla 1 se detallan todas las cepas y plásmidos utilizados para este estudio.
Purificación de la proteína ferritina Para purificar la proteína ferritina se va a hacer una proteína de fusión ferritina- seis colas de histidina. Para ello se amplifica el gen de la ferritina por PCR con los primers diseñados con sitios de corte para NdeI y para NcoI (Tabla 2). Después ese fragmento amplificado se clona en el MCS del plásmido de expresión procariota pET28a, y se expresa en Escherichia coli BL21(DE3) (Novagen, Alemania) (Peng et al. 2009). Las bacterias transformadas se crecen toda la noche a 37ºC en medio LB conteniendo 50µg/ml de kanamicina. Después los cultivos fueron diluidos (1:20) en 50ml de medio LB y se mantuvieron en estufa a 37ºC durante 2h, hasta que la D.O fue de 0.6 (Gao et al. 2009). Y una vez que se alcanzó esa D.O. la expresión fue inducida añadiendo al medio IPTG (Sigma) a una concentración final de 2mM. Las células se crecieron otra vez en medio LB y de esas células cultivadas, una parte se almacena a -80ºC y 0.55g se usan para esta purificación. Esos 0.55g se lisan en hielo en 80ml Buffer A (25mM Tris, pH 8.0, 100mM NaCl, 1mM 2-ME, 0,1% Triton X-100, 10% glicerol), 1mM PMSF (Boehringer Mannheim) y 0.5 mg/ml de lisozima. Después de 1h, las células fueron sonicadas y centrifugadas a 20000g, 30minutos. Se cogió el sobrenadante, y se incubó en una resina de Ni-NTA agarosa (Qiagen). El sobrenadante se pasó por la columna y después las proteínas fueron eluidas con buffer A y con concentraciones en gradiente creciente de imidazol (10, 20 y 40mM) (Kadkhodayan et al. 2000).El eluyente fue analizado finalmente en un gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) al 12%. El plásmido pET28a con inserto de ferritina crecido en E. coli BL21(D3) en ausencia de IPTG se usó como control (Gao et al. 2009). El gel fue después analizado mediante tinción con azul de Coomasie.
Las muestras se corrieron en un gel SDS-PAGE al 12% y después se les hizo un inmunoblot sobre una membrana de PVDF. El anticuerpo primario es un anticuerpo de ratón anti-His (Tiangen, China). También usaremos un anticuerpo secundario comercial para amplificar la señal, que será un anticuerpo de cabra Ig anti-antiratón (Tiangen, China) (Gao et al. 2009). Mutagénesis in vitro En este estudio hemos intentado determinar cómo es la expresión del gen de la ferritina, y cómo varía esa expresión en función de los niveles de hierro en el ambiente y en la célula.
Para verlo hemos construido mutantes de la ferritina mediante mutagénesis dirigida por PCR, construyendo para ello los primers indicados en la Tabla 2. En esta mutagénesis, hemos sustituido una Glicina (aminoácido hidrofóbico conservado que se ve al hacer el alineamiento, Figura 1) por una Serina.
Una vez hecha la PCR vamos a obtener nuestro gen con el aminoácido que queriamos mutado. Y clonamos ese gen en el plásmido suicida y movilizable p0J260 (Strataclone). Para ello, al diseñar los primers les ponemos sitio de corte para HindIII, que es un sitio de corte que se encuentra en el MCS del vector utilizado, pero que no se encuentra en mi gen.
Una vez clonado en este plásmido, transformamos el plásmido en E.coli y después seleccionamos transformantes mediante ampicilina. A continuación hacemos una conjugación con cepa E.coli S-17 y nuestra cepa de Rhodococcus.
En Rhodococcus, el plásmido pOJ260 se va a comportar como un plásmido suicida, por lo que el único modo de expresar el gen mutado es mediante una recombinación simple entre el vector y el cromosoma de Rhodococcus.
Fusión de proteína gfp-ferritina Para ver la localización de nuestra proteína hemos diseñado los primers necesarios (Tabla 2), para fusionar el gen de la ferritina a la Green Fluorescent Protein (GFP), proteína fluorescente verde de la medusa Aequoreavictoria, y clonarlo en el plásmido pUC18a (Clontech)(Tullius, Harth & Horwitz 2001). Después ese vector se mete en cepas competentes de Rhodococcus por electroporación. Estas cepas se han conseguido creciendo a Rhodococcus en 100ml de medio broth BHI (Brain heart infusion) que contiene glicina y después con choque de calor a 50ºC durante 9 min (Sekizaki et al. 1998). Finalmente se seleccionan transformantes en medio TSB con ampicilina (50µg/ml).
Una vez que hemos clonado el plásmido en Rhodococcus se obtiene la ferritina fusionada a la proteína GFP. Las células que contienen las proteínas de fusión observadas en un microscopio de fluorescencia Nikon E400. Las imágenes fueron tomadas con una cámara digital Nikon DN100 y ajustadas usando el programa Corel Draw (Letek et al. 2007).
3.- RESULTADOS
A partir de los distintos experimentos que hemos llevado a cabo, se ha llegado a la conclusión de que la ferritina es una proteína importante que participa en el metabolismo del hierro, por lo que su defecto va a acarrear problemas de estrés oxidativo para la célula. Pero aún así, esta proteína no es una proteína esencial ya que cuando se produce una mutagénesis en el gen que la codifica, la bacteria puede seguir creciendo, aunque lo haga en peores condiciones.
En este estudio al hacer la mutagénesis dirigida por PCR , al comprobar las propiedades de crecimiento tanto de la cepa silvestre como de de los mutantes deficientes en ferritina, se observó que al crecer las cepas en medio LB, el crecimiento de los mutantes era bastante menor que el de la cepa silvestre, y ese crecimiento de los mutantes aún disminuía más cuando eran crecidos en medio Tris; al añadir hierro al medio Tris, se estimulaba tanto el crecimiento de la cepa mutante como el crecimiento de la cepa silvestre. Sin embargo, si se añadía EDDHA (hierro quelado) o 2,2’-dipyridyl (hierro intracelular quelado) (Sigma-Aldrich, Francia), se mantenía la capacidad de crecimiento de la cepa silvestre, pero la del mutante disminuía su crecimiento, probablemente debido a un aumento del estrés oxidativo celular ya que la ferritina no es funcional en ese caso y no protege a la célula de ese estrés (Ver Figura 2)
Por todo ello, parece ser que la glicina, aminoácido conservado que se mutó en este estudio, es una aminoácido hidrofóbico importante para mantener la estructura de la proteína, y que si se cambia por otro aminoácido de naturaleza distinta, por la Serina que es polar, se pierde esa estructura y la proteína que se sintetiza pierde actividad. Después, se introdujo en la cepa mutante el plásmido pOJ260 que contenía el gen silvestre que codifica para la ferritina, y ahora se veía que en esta cepa se reestablecía la capacidad de crecimiento en presencia tanto de EDDHA como de Dipyridyl, como en medio Tris en ausencia de hierro.
Y en el estudio de deleción, al comprobar las propiedades de crecimiento tanto de la cepa silvestre como de las cepas que llevan el gen con la deleción en el gen de la ferritina, se observaron unos resultados similares a los obtenidos al hacer la mutagénesis, aunque con reducciones en el crecimiento bastante más acusadas en este último caso.
En este caso, al crecer las cepas en medio LB, las cepas silvestres tenías un crecimiento bastante mayor que el de las cepas con el gen con un fragmento delecionado. Y el crecimiento de las cepas con el gen con el fragmento delecionado aun disminuía más cuando crecía en medio Tris; al añadir hierro al medio Tris, se estimulaba tanto el crecimiento de la cepa con el gen con el fragmento delecionado como el crecimiento de la cepa silvestre. Sin embargo, si se añadía EDDHA (hierro quelado) o 2,2’-dipyridyl (hierro intracelular quelado) (Sigma-Aldrich, Francia), se mantenía la capacidad de crecimiento de la cepa silvestre, pero la del mutante disminuía su crecimiento casi hasta cero, mucho más que las cepas que se mutaron in vitro, probablemente debido a un aumento del estrés oxidativo celular ya que la ferritina no es funcional en ese caso y no protege a la célula de ese estrés (Gupta, Shah & Swiatlo 2009).
Acorde a estos resultados podemos concluir, que el gen de la ferritina no es un gen esencial en condiciones normales de crecimiento ya que la célula podría vivir sin ese gen, pero sí que es un gen necesario bajo condiciones de alto estrés oxidativo y en medios ricos en hierro, ya que si la célula no tiene ese gen, en esas condiciones las células o no crecen o crecen muy poco (Ver figura 2).
En este estudio se ha visto que la ferritina tiene una función bastante similar en Rhodococcus que la que tiene en Mycobacterium, ya que los resultados obtenidos en Rhodococcus son similares a los que se han hecho en Mycobacterium (Gupta et al. 2008). Y esta hipótesis parece estar sustentada también por los análisis filogenéticos, donde se ve que la proteína ferritina de Rhodococcus guarda alta similaridad con la ferritina de Mycobacterium y Nocardia, ambas Gram+ de alto contenido en G+C (Ver figura 3)
Además de intentar averiguar la función de esta proteína en Rhodococcus sp haciendo deleciones y mutagénesis, también hemos averiguado su localización en la célula mediante fusión a la proteína GFP y hemos visto su concentración a lo largo del crecimiento de Rhodococcus sp. Está proteína es una proteína citosólica.
Finalmente hemos logrado purificar la proteína mediante su fusión a colas de Histidina. Para ello el gen de la ferritina fue amplificado por PCR, clonado y expresado en el plásmido pET28a, aguas abajo de la región His-taq, y las células inducidas mediante IPTG fueron analizadas mediante un SDS-PAGE. El peso molecular de la proteína es el mismo que el que se predecía según el programa Expasy, de 20kD (Ver figura 4).
Se observó que se purificaba la fracción soluble de la proteína ferritina expresada en E.coli BL21(DL3), y al eluir en la cromatografía de afinidad Ni-NTA agarosa, nuestra proteína era eluida a concentraciones muy bajas de imidazol (20mM), lo que nos indica que su unión a la columna era muy débil. Y esta debilidad en la unión de la ferritina a la columna podría explicarse si las colas de His unidas a la ferritina, estaban inaccesibles a la superficie, como resultado de un alto empaquetamiento a la ferritina (Kadkhodayan et al. 2000). Esta proteína no era muy estable y precipitaba a los pocos días si se almacenaba a -4ºC. Por ello, para aumentar la solubilidad y estabilidad de la proteína, así como para simplificar su purificación se están intentando nuevos método de purificación, tales como añadir al extremo N-terminal de la proteína un GST-tag y clonarla en el vector de expresión pEGX-2T, que se expresará en E.coli JM109, y después mediante trombina separar los dos componentes de la proteína de fusión formada.
Finalmente, observamos en microscopio de fluorescencia la ferritina fusionada a la proteína fluorescente verde. Este análisis microscópico nos indica que nuestra proteína es una proteína citosólica, y que se sintetiza en altas cantidades cuando la bacteria crece en medio suplementado con hierro, mientras que si la bacteria crece en medio no suplementado con hierro, se ve que la cantidad expresada de ferritina es mucho menor (Imágenes no proporcionadas en este estudio). Análisis bioinformático de la ferritina La ferritina que estamos estudiando de Rhodococcus sp. fue analizada mediante diferentes programas informáticos para ver sus características físico-químicas. Esta proteína, tiene 181 aminoácidos y un peso molecular de 20.145,4 Dalton. Su punto isoeléctrico es 4.45 y su composición de aminoácidos es la siguiente:
Ala (A) 24
13.3%
Arg (R) 11
6.1%
Asn (N) 4
2.2%
Asp (D) 14
7.7%
Cys (C) 0
0.0%
Gln (Q) 12
6.6%
Glu (E) 14
7.7%
Gly (G) 7
3.9%
His (H) 4
2.2%
Ile (I) 7
3.9%
Leu (L) 12
6.6%
Lys (K) 2
1.1%
Met (M) 6
3.3%
Phe (F) 9
5.0%
Pro (P) 5
2.8%
Ser (S) 10
5.5%
Thr (T) 16
8.8%
Trp (W) 1
0.6%
Tyr (Y) 6
3.3%
Val (V) 17
9.4%
También se analizó la proteína con el programa PSORTb (Gardy et al. 2005), y según este programa se predice que se trata de una proteína citosólica, característica que también se corroboró mediante el análisis con GFP.
Al analizar la secuencia mediante el programa TMHMM server v. 2.0 (Universidad técnica de Dinamarca, DTU) se ve que ésta proteína no tiene dominios transmembrana (Figura 5)
También hicimos mediante el programa bioinformático expasy (expasy es una página web) un análisis de hidrofobicidad de la proteína y vimos cómo era su estructura (Figura 6 y 7).
ANEXOS
ANEXO 1: CEPAS Y PLÁSMIDOS UTILIZADOS EN ESTE TRABAJO
Cepas bacterianas y plásmidos utilizados
Características de la cepa o plásmido
Rhodococcus sp
Cepa utilizada en este estudio.
E. coli BL21(DE3)
Cepa utilizada para la purificación de la ferritina, para clonar el plásmido pUC18.
E.coli SK-17
Cepa utilizada como donadora en el proceso de conjugación entre E. coli y Rhodococcus sp.
Contiene integrados en su cromosoma los genes tradel plásmido conjugativo RP4, que le confieren la capacidad de transferir vía conjugativa plásmidos movilizables en los que se pueden clonar los fragmentos de ADN de interés.
Genotipo: hds pro recA Tc::Mu
E. coli Top10
Cepa utilizada en los experimentos de transformación debido a su alta eficiencia de transformación. Genotipo: F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 deoR recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL endA1 nupG
pET28a (Novagen)
Vector que contiene el origen de replicación ColE1 de E. coliy un gen de resistencia a kanamicina. Permite fusionar a un gen en los extremos 5’ o 3’ secuencias que codificanpara 6 histidinas.
pOJ260
Vector suicida y mobilizable de 3.5 Kb que contiene un origen de replicación de E.coli 1 un oriT , un gen de resistencia a ampicilina y el gen lac, en el que está el MCS.
pUC18 (Fermentas)
Vector suicida de 2686pb de alto número de copias, que tiene el gen rep y carece del gen rop. Tiene un gen de resistencia a ampicilina y el gen lacZ, dentro del cual se encuentra el MCS
ANEXO 2: PRIMERS UTILIZADOS EN ESTE TRABAJO
Experimento
Secuencia de oligonucleótidos (5’-3')
Purificación de la ferritina
GGAATCCATATGACTGACGCGGC (NdeI)
AAACCCATGGTCAGGCGCCC (NcoI)
Fusión de la proteína GFP- ferritina
CCCAAGCTTATGACTGACGCGG (HindIII)
CCCAAGCTTTTATTTGTATAGTTCATCCATG (HindIII)
CCTTTACTCATGGCGCCCGAG (Primer fusión2)
CTCGGGCGCCATGAGTAAAGG(Primer fusión3)
Interrupción génica de la ferritina
CCCAAGCTTatgactgacgcgg (HindIII)
CCCAAGCTTTCAGGCGCCC(HindIII)
CTGGACCGTTGTCGATCAGGTAC (Primer interno2)
GACAACGGTCCAGTGGTTCCTCAAGGA (Primer interno3)
Mutación in vitro de la ferritina
CCCAAGCTTatgactgacgcgg (HindIII)
CCCAAGCTTTCAGGCGCCC (HindIII)
gatcgcgccAgtgacaactacttc (Primer mutagénico 1)
GAAGTAGTTGTCACTGGCGCGATC (Primer mutagénico 2)
ANEXO 3: PROGRAMAS INFORMÁTICOS UTILIZADOS EN ESTE TRABAJO
Programa informático
Aplicaciones
ARTEMIS
Proporciona los Open Reading Frame de una secuencia de nucleótidos.
BLAST
Identificación de secuencias por homología.
CLUSTAL W2
Alineamientos de secuencias y estudios filogenéticos
EXPASY
Determinar las distintas características y parámetros físico-químicos de las proteínas.
MANIPULATE AND DISPLAY A DNA SEQUENCE
Permite obtener a partir de una cadena de DNA la complementaria, la reversa, la reversa y complementaria. Útil para el diseño de primers.
MEGA 4.1
Análisis filogenéticos llevados a cabo mediante el método neighbour-joining
NCBI
Búsquedas bibliográficas, taxonómicas y de secuencias.
NATURAL NETWORK PROMOTER PREDICTION
Identificación de posibles promotores
NEBCUTTER V2.0
Indica todas los sitios de corte para todas las enzimas tipoII y tipoIII que hay en una secuencia de DNA asi como las enzimas de restricción que no cortan una secuencia de DNA.
OLIGO CALCULATOR
Cálculo empírico de la temperatura de fusión de los primers utilizados
PRIMER 3 PLUS
Escoge primers internos dentro de una secuencia de DNA
Identificación de posibles terminadores de la transcripción.
SIXPACK
Proporciona los seis marcos de lectura que se codifican en una secuencia de DNA.
Figura 1.Alineamiento de la proteina ferritina en distintas especies de Actinomicetos, de alto contenido en G+C. En rojo vemos los dominios conservados, donde se puede hacer una mutación para ver la diferencia entre las colonias con la proteina silvestre y las colonias con la proteina mutada.En este estudio hemos mutado la glicina 148 y la hemos cambiado por una serina.
Figura 2. Capacidad de crecimiento de los mutantes de ferritina en la cepa mutante en comparación con la cepa silvestre en medio Tris con diferente disponibilidad de hierro. Se reflejan las tasas de densidad celular de la cepa a estudiar/cepa silvestre ± SD, ya que se hicieron tres experimentos para obtener estos resultados. Tomado de Boughammoura et al., 2008.
Figura 3: Análisis filogenético de la ferritina en diferentes especies de microorganismos según el método de neighbour-joining mediante el programa Mega 4.1(Tamura et al. 2007)
Figura 4: Análisis electroforético de la ferritina. Carril 1: Extracto total de proteína de la cepa E.coli BL21(DL3). Carril 2: Extracto de proteína total sin la inducción de IPTG, contiene el plásmido pET28a+ferritina. Carril 3: Extracto de proteína total bajo la inducción de IPTG, contiene el plásmido pET28a+ferritina. Carril 4: Marcador de tamaño para proteínas. Tomada de Peng et al., 2009.
Figura 5: Análisis de la secuencia mediante el programa TMHMM server v. 2.0 (Universidad técnica de Dinamarca, DTU) donde se ve que ésta proteína no tiene dominios transmembrana.
Figura 6: Perfil de hidrofobicidad de la proteina
Figura 7: Estructura de la proteina analizada mediante el programa Expasy.
Abdul-Tehrani, H., Hudson, A.J., Chang, Y.S., Timms, A.R., Hawkins, C., Williams, J.M., Harrison, P.M., Guest, J.R. & Andrews, S.C. 1999, "Ferritin mutants of Escherichia coli are iron deficient and growth impaired, and fur mutants are iron deficient", Journal of Bacteriology, vol. 181, no. 5, pp. 1415-1428.
Bolann, B.J. & Ulvik, R.J. 1990, "On the limited ability of superoxide to release iron from ferritin", European journal of biochemistry / FEBS, vol. 193, no. 3, pp. 899-904.
Chen, S., Bleam, W.F. & Hickey, W.J. 2009, "Simultaneous analysis of bacterioferritin gene expression and intracellular iron status in Pseudomonas putida KT2440 by using a rapid dual luciferase reporter assay", Applied and Environmental Microbiology, vol. 75, no. 3, pp. 866-868.
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Gao, P.F., Cao, G.Q., Zhao, H.T., Zhang, G.X., Jiang, Y.S. & Wang, Q.D. 2009, "Molecular cloning and characterization of pigeon (Columba liva) ubiquitin and ubiquitin-conjugating enzyme genes from pituitary gland library", International journal of biological sciences, vol. 5, no. 1, pp. 34-43.
Gardy, J.L., Laird, M.R., Chen, F., Rey, S., Walsh, C.J., Ester, M. & Brinkman, F.S. 2005, "PSORTb v.2.0: expanded prediction of bacterial protein subcellular localization and insights gained from comparative proteome analysis", Bioinformatics (Oxford, England), vol. 21, no. 5, pp. 617-623.
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Gema Lordén Losada (1)
(1)Departamento de Biología Molecular, Area de Microbiologia, Facultad de Biología, Universidad de León, España.
Resumen
La ferritina es una proteína capaz de almacenar hierro que se cree que desempeña un papel fundamental en la homeostasis de este metal en las bacterias del suelo, secuestrándolo cuando la célula lo toma en exceso, y liberándolo cuando es escaso para que la célula satisfaga sus necesidades metabólicas. Para aclarar la función de esta proteína en Rhodococcus, en este estudio se han obtenido mutantes y se ha delecionado el gen de la ferritina, viendo que los mutantes y las cepas que llevan el gen de la ferritina delecionado crecen peor en situaciones en las que hay exceso de hierro debido a que entran en estrés oxidativo. Así mismo también se purificó la proteína y se fusionó a la proteína GFP, para así ver su localización y como varía su concentración a lo largo del crecimiento celular.
Palabras clave: Rhodococcus sp., ferritina, mutagénesis, deleción, purificación, GFP.
1. INTRODUCCIÓN
Los miembros del género Rhodococcus están ampliamente distribuidos en los ambientes naturales, tales como suelos, aguas y sedimentos marinos. Este género pertenece a un grupo de microorganismos no esporulados, cuya principal característica es la presencia de ácidos micólicos y derivados en la pared celular , lo que los clasifica dentro de la clase Actinobacteria, junto con otros géneros relacionados como Mycobacterium, Nocardia, Corynebacterium y Gordonia (Hernandez et al. 2008). Actualmente, los miembros del género Rhodococcus aparecen en el volumen 4, sección XXIII de la segunda edición del Manual de Bergey de Bacteriología Sistemática (Garrity et al., 2002) como microorganismos Gram- positivos de elevado contenido en G+C, en lo que constituye la clase Actinobacteria, anteriormente citada.
Clasificación taxonómica del género Rhodococcus:
Reino: Bacteria
Filo: Actinobacteria
Clase: Actinobacteria
Subclase: Actinobacteridae
Orden: Actinomycetales
Suborden: Corynebacterineae
Familia: Nocardiaceae
Género: Rhodococcus
En este estudio hemos intentado averiguar cual es la función que desempeña la ferritina en Rhodococcus sp. (a partir de aquí se olvidó de poner cursivas)
El hierro es un elemento esencial para casi todas las formas de vida, pero su insolubilidad y su alta reactividad pueden conducir a problemas de baja disponibilidad y toxicidad (en exceso induce estrés oxidativo) respectivamente (Chen, Bleam & Hickey 2009, Chen, Bleam & Hickey 2009). Un mecanismo usado para que las células tengan un aporte suficiente de hierro sin que entren en un estado tóxico, implica la presencia de proteínas capaces de almacenar este metal, conocidas generalmente por el nombre de ferritinas (Abdul-Tehrani et al. 1999). Las ferritinas han sido encontradas en animales, plantas y bacterias, donde se cree que juegan un importante papel en la homeostasis celular del hierro; lo secuestran cuando la célula lo toma en exceso, y lo liberan cuando es escaso para que la célula satisfaga sus necesidades metabólicas (Shi et al. 2008).
La importancia de las ferritinas se cree que radica en que almacenan el hierro en una forma rápidamente disponible y soluble para que puedan ser utilizadas como reservorio de hierro para el metabolismo, así como también podrían aliviar los efectos dañinos del hierro almacenándolo en una forma que no participa en las reacciones que generan radicales libres.(Bolann, Ulvik 1990)
2. MATERIALES Y MÉTODOS
Medios de Cultivo:
Las cepas de Rhodococcus fueron cultivas aeróbicamente y crecidas a 30ºC en medio TSB (triptic soy broth) y las cepas de Escherichia coli fueron crecidas en medio LB (Luria Bertani) a 37ºC. En ambos casos se incubaron 50ml en matraces Erlenmeyer de 250 ml, agitándolos a 200rpm. El crecimiento celular se determinó monitorizando la densidad óptica a 600nm (DO600)(Dosanjh, Newton & Davies 2008). En los casos en los que se utilizó otro medio de cultivo y cuando éstos sean suplementados con antibióticos será indicado. En la tabla 1 se detallan todas las cepas y plásmidos utilizados para este estudio.
Purificación de la proteína ferritina
Para purificar la proteína ferritina se va a hacer una proteína de fusión ferritina- seis colas de histidina. Para ello se amplifica el gen de la ferritina por PCR con los primers diseñados con sitios de corte para NdeI y para NcoI (Tabla 2). Después ese fragmento amplificado se clona en el MCS del plásmido de expresión procariota pET28a, y se expresa en Escherichia coli BL21(DE3) (Novagen, Alemania) (Peng et al. 2009). Las bacterias transformadas se crecen toda la noche a 37ºC en medio LB conteniendo 50µg/ml de kanamicina. Después los cultivos fueron diluidos (1:20) en 50ml de medio LB y se mantuvieron en estufa a 37ºC durante 2h, hasta que la D.O fue de 0.6 (Gao et al. 2009). Y una vez que se alcanzó esa D.O. la expresión fue inducida añadiendo al medio IPTG (Sigma) a una concentración final de 2mM. Las células se crecieron otra vez en medio LB y de esas células cultivadas, una parte se almacena a -80ºC y 0.55g se usan para esta purificación. Esos 0.55g se lisan en hielo en 80ml Buffer A (25mM Tris, pH 8.0, 100mM NaCl, 1mM 2-ME, 0,1% Triton X-100, 10% glicerol), 1mM PMSF (Boehringer Mannheim) y 0.5 mg/ml de lisozima. Después de 1h, las células fueron sonicadas y centrifugadas a 20000g, 30minutos. Se cogió el sobrenadante, y se incubó en una resina de Ni-NTA agarosa (Qiagen). El sobrenadante se pasó por la columna y después las proteínas fueron eluidas con buffer A y con concentraciones en gradiente creciente de imidazol (10, 20 y 40mM) (Kadkhodayan et al. 2000).El eluyente fue analizado finalmente en un gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) al 12%. El plásmido pET28a con inserto de ferritina crecido en E. coli BL21(D3) en ausencia de IPTG se usó como control (Gao et al. 2009). El gel fue después analizado mediante tinción con azul de Coomasie.
Las muestras se corrieron en un gel SDS-PAGE al 12% y después se les hizo un inmunoblot sobre una membrana de PVDF. El anticuerpo primario es un anticuerpo de ratón anti-His (Tiangen, China). También usaremos un anticuerpo secundario comercial para amplificar la señal, que será un anticuerpo de cabra Ig anti-antiratón (Tiangen, China) (Gao et al. 2009).
Mutagénesis in vitro
En este estudio hemos intentado determinar cómo es la expresión del gen de la ferritina, y cómo varía esa expresión en función de los niveles de hierro en el ambiente y en la célula.
Para verlo hemos construido mutantes de la ferritina mediante mutagénesis dirigida por PCR, construyendo para ello los primers indicados en la Tabla 2. En esta mutagénesis, hemos sustituido una Glicina (aminoácido hidrofóbico conservado que se ve al hacer el alineamiento, Figura 1) por una Serina.
Una vez hecha la PCR vamos a obtener nuestro gen con el aminoácido que queriamos mutado. Y clonamos ese gen en el plásmido suicida y movilizable p0J260 (Strataclone). Para ello, al diseñar los primers les ponemos sitio de corte para HindIII, que es un sitio de corte que se encuentra en el MCS del vector utilizado, pero que no se encuentra en mi gen.
Una vez clonado en este plásmido, transformamos el plásmido en E.coli y después seleccionamos transformantes mediante ampicilina. A continuación hacemos una conjugación con cepa E.coli S-17 y nuestra cepa de Rhodococcus.
En Rhodococcus, el plásmido pOJ260 se va a comportar como un plásmido suicida, por lo que el único modo de expresar el gen mutado es mediante una recombinación simple entre el vector y el cromosoma de Rhodococcus.
Fusión de proteína gfp-ferritina
Para ver la localización de nuestra proteína hemos diseñado los primers necesarios (Tabla 2), para fusionar el gen de la ferritina a la Green Fluorescent Protein (GFP), proteína fluorescente verde de la medusa Aequorea victoria, y clonarlo en el plásmido pUC18a (Clontech)(Tullius, Harth & Horwitz 2001). Después ese vector se mete en cepas competentes de Rhodococcus por electroporación. Estas cepas se han conseguido creciendo a Rhodococcus en 100ml de medio broth BHI (Brain heart infusion) que contiene glicina y después con choque de calor a 50ºC durante 9 min (Sekizaki et al. 1998). Finalmente se seleccionan transformantes en medio TSB con ampicilina (50µg/ml).
Una vez que hemos clonado el plásmido en Rhodococcus se obtiene la ferritina fusionada a la proteína GFP. Las células que contienen las proteínas de fusión observadas en un microscopio de fluorescencia Nikon E400. Las imágenes fueron tomadas con una cámara digital Nikon DN100 y ajustadas usando el programa Corel Draw (Letek et al. 2007).
3.- RESULTADOS
A partir de los distintos experimentos que hemos llevado a cabo, se ha llegado a la conclusión de que la ferritina es una proteína importante que participa en el metabolismo del hierro, por lo que su defecto va a acarrear problemas de estrés oxidativo para la célula. Pero aún así, esta proteína no es una proteína esencial ya que cuando se produce una mutagénesis en el gen que la codifica, la bacteria puede seguir creciendo, aunque lo haga en peores condiciones.
En este estudio al hacer la mutagénesis dirigida por PCR , al comprobar las propiedades de crecimiento tanto de la cepa silvestre como de de los mutantes deficientes en ferritina, se observó que al crecer las cepas en medio LB, el crecimiento de los mutantes era bastante menor que el de la cepa silvestre, y ese crecimiento de los mutantes aún disminuía más cuando eran crecidos en medio Tris; al añadir hierro al medio Tris, se estimulaba tanto el crecimiento de la cepa mutante como el crecimiento de la cepa silvestre. Sin embargo, si se añadía EDDHA (hierro quelado) o 2,2’-dipyridyl (hierro intracelular quelado) (Sigma-Aldrich, Francia), se mantenía la capacidad de crecimiento de la cepa silvestre, pero la del mutante disminuía su crecimiento, probablemente debido a un aumento del estrés oxidativo celular ya que la ferritina no es funcional en ese caso y no protege a la célula de ese estrés (Ver Figura 2)
Por todo ello, parece ser que la glicina, aminoácido conservado que se mutó en este estudio, es una aminoácido hidrofóbico importante para mantener la estructura de la proteína, y que si se cambia por otro aminoácido de naturaleza distinta, por la Serina que es polar, se pierde esa estructura y la proteína que se sintetiza pierde actividad.
Después, se introdujo en la cepa mutante el plásmido pOJ260 que contenía el gen silvestre que codifica para la ferritina, y ahora se veía que en esta cepa se reestablecía la capacidad de crecimiento en presencia tanto de EDDHA como de Dipyridyl, como en medio Tris en ausencia de hierro.
Y en el estudio de deleción, al comprobar las propiedades de crecimiento tanto de la cepa silvestre como de las cepas que llevan el gen con la deleción en el gen de la ferritina, se observaron unos resultados similares a los obtenidos al hacer la mutagénesis, aunque con reducciones en el crecimiento bastante más acusadas en este último caso.
En este caso, al crecer las cepas en medio LB, las cepas silvestres tenías un crecimiento bastante mayor que el de las cepas con el gen con un fragmento delecionado. Y el crecimiento de las cepas con el gen con el fragmento delecionado aun disminuía más cuando crecía en medio Tris; al añadir hierro al medio Tris, se estimulaba tanto el crecimiento de la cepa con el gen con el fragmento delecionado como el crecimiento de la cepa silvestre. Sin embargo, si se añadía EDDHA (hierro quelado) o 2,2’-dipyridyl (hierro intracelular quelado) (Sigma-Aldrich, Francia), se mantenía la capacidad de crecimiento de la cepa silvestre, pero la del mutante disminuía su crecimiento casi hasta cero, mucho más que las cepas que se mutaron in vitro, probablemente debido a un aumento del estrés oxidativo celular ya que la ferritina no es funcional en ese caso y no protege a la célula de ese estrés (Gupta, Shah & Swiatlo 2009).
Acorde a estos resultados podemos concluir, que el gen de la ferritina no es un gen esencial en condiciones normales de crecimiento ya que la célula podría vivir sin ese gen, pero sí que es un gen necesario bajo condiciones de alto estrés oxidativo y en medios ricos en hierro, ya que si la célula no tiene ese gen, en esas condiciones las células o no crecen o crecen muy poco (Ver figura 2).
En este estudio se ha visto que la ferritina tiene una función bastante similar en Rhodococcus que la que tiene en Mycobacterium, ya que los resultados obtenidos en Rhodococcus son similares a los que se han hecho en Mycobacterium (Gupta et al. 2008). Y esta hipótesis parece estar sustentada también por los análisis filogenéticos, donde se ve que la proteína ferritina de Rhodococcus guarda alta similaridad con la ferritina de Mycobacterium y Nocardia, ambas Gram+ de alto contenido en G+C (Ver figura 3)
Además de intentar averiguar la función de esta proteína en Rhodococcus sp haciendo deleciones y mutagénesis, también hemos averiguado su localización en la célula mediante fusión a la proteína GFP y hemos visto su concentración a lo largo del crecimiento de Rhodococcus sp. Está proteína es una proteína citosólica.
Finalmente hemos logrado purificar la proteína mediante su fusión a colas de Histidina. Para ello el gen de la ferritina fue amplificado por PCR, clonado y expresado en el plásmido pET28a, aguas abajo de la región His-taq, y las células inducidas mediante IPTG fueron analizadas mediante un SDS-PAGE. El peso molecular de la proteína es el mismo que el que se predecía según el programa Expasy, de 20kD (Ver figura 4).
Se observó que se purificaba la fracción soluble de la proteína ferritina expresada en E.coli BL21(DL3), y al eluir en la cromatografía de afinidad Ni-NTA agarosa, nuestra proteína era eluida a concentraciones muy bajas de imidazol (20mM), lo que nos indica que su unión a la columna era muy débil. Y esta debilidad en la unión de la ferritina a la columna podría explicarse si las colas de His unidas a la ferritina, estaban inaccesibles a la superficie, como resultado de un alto empaquetamiento a la ferritina (Kadkhodayan et al. 2000). Esta proteína no era muy estable y precipitaba a los pocos días si se almacenaba a -4ºC. Por ello, para aumentar la solubilidad y estabilidad de la proteína, así como para simplificar su purificación se están intentando nuevos método de purificación, tales como añadir al extremo N-terminal de la proteína un GST-tag y clonarla en el vector de expresión pEGX-2T, que se expresará en E.coli JM109, y después mediante trombina separar los dos componentes de la proteína de fusión formada.
Finalmente, observamos en microscopio de fluorescencia la ferritina fusionada a la proteína fluorescente verde. Este análisis microscópico nos indica que nuestra proteína es una proteína citosólica, y que se sintetiza en altas cantidades cuando la bacteria crece en medio suplementado con hierro, mientras que si la bacteria crece en medio no suplementado con hierro, se ve que la cantidad expresada de ferritina es mucho menor (Imágenes no proporcionadas en este estudio).
Análisis bioinformático de la ferritina
La ferritina que estamos estudiando de Rhodococcus sp. fue analizada mediante diferentes programas informáticos para ver sus características físico-químicas. Esta proteína, tiene 181 aminoácidos y un peso molecular de 20.145,4 Dalton. Su punto isoeléctrico es 4.45 y su composición de aminoácidos es la siguiente:
También se analizó la proteína con el programa PSORTb (Gardy et al. 2005), y según este programa se predice que se trata de una proteína citosólica, característica que también se corroboró mediante el análisis con GFP.
Al analizar la secuencia mediante el programa TMHMM server v. 2.0 (Universidad técnica de Dinamarca, DTU) se ve que ésta proteína no tiene dominios transmembrana (Figura 5)
También hicimos mediante el programa bioinformático expasy (expasy es una página web) un análisis de hidrofobicidad de la proteína y vimos cómo era su estructura (Figura 6 y 7).
ANEXOS
ANEXO 1: CEPAS Y PLÁSMIDOS UTILIZADOS EN ESTE TRABAJO
Cepas bacterianas y plásmidos utilizados
Características de la cepa o plásmido
Rhodococcus sp
Cepa utilizada en este estudio.
E. coli BL21(DE3)
Cepa utilizada para la purificación de la ferritina, para clonar el plásmido pUC18.
E.coli SK-17
Cepa utilizada como donadora en el proceso de conjugación entre E. coli y Rhodococcus sp.
Contiene integrados en su cromosoma los genes tra del plásmido conjugativo RP4, que le confieren la capacidad de transferir vía conjugativa plásmidos movilizables en los que se pueden clonar los fragmentos de ADN de interés.
Genotipo: hds pro recA Tc::Mu
E. coli Top10
Genotipo: F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 deoR recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL endA1 nupG
pET28a (Novagen)
kanamicina. Permite fusionar a un gen en los extremos 5’ o 3’ secuencias que codificanpara 6 histidinas.
pOJ260
pUC18 (Fermentas)
ANEXO 2: PRIMERS UTILIZADOS EN ESTE TRABAJO
Purificación de la ferritina
GGAATCCATATGACTGACGCGGC (NdeI)
AAACCCATGGTCAGGCGCCC (NcoI)
Fusión de la proteína GFP- ferritina
CCCAAGCTTATGACTGACGCGG (HindIII)
CCCAAGCTTTTATTTGTATAGTTCATCCATG (HindIII)
CCTTTACTCATGGCGCCCGAG (Primer fusión2)
CTCGGGCGCCATGAGTAAAGG(Primer fusión3)
Interrupción génica de la ferritina
CCCAAGCTTatgactgacgcgg (HindIII)
CCCAAGCTTTCAGGCGCCC(HindIII)
CTGGACCGTTGTCGATCAGGTAC (Primer interno2)
GACAACGGTCCAGTGGTTCCTCAAGGA (Primer interno3)
Mutación in vitro de la ferritina
CCCAAGCTTatgactgacgcgg (HindIII)
CCCAAGCTTTCAGGCGCCC (HindIII)
gatcgcgccAgtgacaactacttc (Primer mutagénico 1)
GAAGTAGTTGTCACTGGCGCGATC (Primer mutagénico 2)
ANEXO 3: PROGRAMAS INFORMÁTICOS UTILIZADOS EN ESTE TRABAJO
Programa informático
Aplicaciones
ARTEMIS
Proporciona los Open Reading Frame de una secuencia de nucleótidos.
BLAST
Identificación de secuencias por homología.
CLUSTAL W2
Alineamientos de secuencias y estudios filogenéticos
EXPASY
Determinar las distintas características y parámetros físico-químicos de las proteínas.
MANIPULATE AND DISPLAY A DNA SEQUENCE
Permite obtener a partir de una cadena de DNA la complementaria, la reversa, la reversa y complementaria. Útil para el diseño de primers.
MEGA 4.1
Análisis filogenéticos llevados a cabo mediante el método neighbour-joining
NCBI
Búsquedas bibliográficas, taxonómicas y de secuencias.
NATURAL NETWORK PROMOTER PREDICTION
Identificación de posibles promotores
NEBCUTTER V2.0
Indica todas los sitios de corte para todas las enzimas tipoII y tipoIII que hay en una secuencia de DNA asi como las enzimas de restricción que no cortan una secuencia de DNA.
OLIGO CALCULATOR
Cálculo empírico de la temperatura de fusión de los primers utilizados
PRIMER 3 PLUS
Escoge primers internos dentro de una secuencia de DNA
Identificación de posibles terminadores de la transcripción.
SIXPACK
Proporciona los seis marcos de lectura que se codifican en una secuencia de DNA.
Figura 1.Alineamiento de la proteina ferritina en distintas especies de Actinomicetos, de alto contenido en G+C. En rojo vemos los dominios conservados, donde se puede hacer una mutación para ver la diferencia entre las colonias con la proteina silvestre y las colonias con la proteina mutada.En este estudio hemos mutado la glicina 148 y la hemos cambiado por una serina.
Figura 2. Capacidad de crecimiento de los mutantes de ferritina en la cepa mutante en comparación con la cepa silvestre en medio Tris con diferente disponibilidad de hierro. Se reflejan las tasas de densidad celular de la cepa a estudiar/cepa silvestre ± SD, ya que se hicieron tres experimentos para obtener estos resultados. Tomado de Boughammoura et al., 2008.
Figura 3: Análisis filogenético de la ferritina en diferentes especies de microorganismos según el método de neighbour-joining mediante el programa Mega 4.1(Tamura et al. 2007)
Figura 4: Análisis electroforético de la ferritina. Carril 1: Extracto total de proteína de la cepa E.coli BL21(DL3). Carril 2: Extracto de proteína total sin la inducción de IPTG, contiene el plásmido pET28a+ferritina. Carril 3: Extracto de proteína total bajo la inducción de IPTG, contiene el plásmido pET28a+ferritina. Carril 4: Marcador de tamaño para proteínas. Tomada de Peng et al., 2009.
Figura 5: Análisis de la secuencia mediante el programa TMHMM server v. 2.0 (Universidad técnica de Dinamarca, DTU) donde se ve que ésta proteína no tiene dominios transmembrana.
Figura 6: Perfil de hidrofobicidad de la proteina
Figura 7: Estructura de la proteina analizada mediante el programa Expasy.
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